前言
結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是胃腸道中常見(jiàn)的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，隨著癌腫的增大而表現(xiàn)排便習(xí)慣改變、便血、腹瀉腹瀉與便秘交替、局部腹痛等癥狀，晚期則表現(xiàn)貧血、體重減輕等全身癥狀。其發(fā)病率和病死率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌。近20年來(lái)，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類健康， 故結(jié)直腸癌研究逐步成為近年來(lái)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，由此引發(fā)的各類動(dòng)物模型的研究備受關(guān)注。
誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型制作方法相對(duì)簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可以在較短時(shí)間內(nèi)大量復(fù)制，而且基本模擬癌變的過(guò)程，因此，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較廣。但是，由于誘發(fā)性腫瘤實(shí)驗(yàn)因存在環(huán)保問(wèn)題而需防護(hù)設(shè)施，實(shí)驗(yàn)條件要求較高。目前，建立直結(jié)腸癌誘發(fā)模型最常用的試劑是二甲基肼(dimethylhydrazine,DMH)和其代謝產(chǎn)物氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)，由于AOM相比DMH具有致癌作用穩(wěn)定、高效的特點(diǎn)，現(xiàn)正被越來(lái)越多的研究者采用。另外，隨著近年來(lái)研究顯示長(zhǎng)期反復(fù)的炎癥性腸病(IBD)可以誘發(fā)直結(jié)腸癌，目前也采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)聯(lián)合AOM聯(lián)合制備炎癥相關(guān)性直結(jié)腸癌模型。
部分造模方法
使用動(dòng)物：小鼠
【造模機(jī)制】：
1.DMH法 DMH本身并不致癌，須經(jīng)氧化脫烷基才具有致癌作用。DMH在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被氧化成甲基氧化偶氮甲醇，與β－葡萄糖醛酸結(jié)合，一部分經(jīng)尿排出，一部分隨膽汁進(jìn)入腸腔，在腸道細(xì)菌和腸黏膜上皮β－葡萄糖苷酸酶的作用下，甲基氧化偶氮甲醇重新游離，成為腸道終末致癌物并最終引起結(jié)直腸上皮癌變。
2.AOM法 AOM是DMH在肝臟的代謝產(chǎn)物，作用過(guò)程與DMH相似，它通過(guò)DNA烷化，促進(jìn)堿基的錯(cuò)誤配對(duì)而致癌。這兩種化學(xué)致癌物都可以誘發(fā)降結(jié)腸腫瘤，組織學(xué)表現(xiàn)類似人類散發(fā)性結(jié)腸癌。由于AOM相比DMH具有致癌作用穩(wěn)定、高效的特點(diǎn)，現(xiàn)正被越來(lái)越多的研究者采用。
3.AOM聯(lián)合DSS法 DSS是人工合成的一種硫酸多糖，將DSS溶解于水給敏感種系的小鼠或大鼠飲用，可引起以血便、潰瘍和粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的結(jié)腸炎癥，其病理改變接近人類潰瘍性結(jié)腸炎。DSS腸炎的發(fā)生可能與其影響DNA合成、抑制上皮細(xì)胞增生、破壞腸黏膜屏障、巨噬細(xì)胞功能障礙及腸道菌群失調(diào)等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，DSS所導(dǎo)致的炎癥以Th1/Th2細(xì)胞功能失調(diào)為特征，造成急性腸炎，經(jīng)過(guò)多個(gè)循環(huán)喂養(yǎng)動(dòng)物也可產(chǎn)生慢性腸炎，并伴有一定的腸癌發(fā)生率。加之AOM自身對(duì)腸道的影響，兩者聯(lián)合可以誘發(fā)穩(wěn)定的炎癥性腸癌。
【造模方法】：
1.DMH法 選取4月齡雄性Wistar大鼠，將DMH用生理鹽水配制成濃度為4mg/ml的溶液，用1mol/L NaHCO3溶液或0.1mol/L NaOH溶液調(diào)pH為6.5，用0.22µm微孔濾器過(guò)濾除菌后備用。該濃度注射液腹腔注射，每次劑量21mg/kg，每周1次，連續(xù)20周。
2.AOM法 生理鹽水配制成濃度為1.25g/L溶液，選用6周齡雌性ICR小鼠，10mg/kg體重每周一次，腹腔注射，連續(xù)應(yīng)用4周，觀察時(shí)間選擇實(shí)驗(yàn)第36周，以腫瘤發(fā)生為觀察終點(diǎn)。
3.AOM/DSS法 選用雌性ICR、C57BL/6J或Balb/c小鼠均可。通常選用相對(duì)分子質(zhì)量為40 000的DSS。第1天小鼠腹腔注射7.5~12.5mg/ kg AOM, 1周后飼喂(1%~3%)DSS1周，之后改為正常飲水14天為一個(gè)循環(huán)，共循環(huán)3次，稱之為“四步法”。“兩步法”與前者的區(qū)別在于將3次循環(huán)的DSS處理以后不做特殊處理縮短為單次循環(huán)，共兩步完成。四步法較兩步法加速了腫瘤的生成，詳細(xì)步驟如圖7-5所示。
圖7-5 AOM/DSS模型誘導(dǎo)方法
注：A.四步法；B.二步法。1：表示1周后飼喂DSS飲用水；2：表示即時(shí)飼喂DSS
【模型特點(diǎn)】：
1.DMH法 ①最后一次給藥后1~4周后處死動(dòng)物，直結(jié)腸癌誘發(fā)率達(dá)到81%~100%，誘發(fā)的腫瘤均為惡性腫瘤，絕大多數(shù)為腺癌。②誘癌過(guò)程中，大鼠腸黏膜上皮依次出現(xiàn)輕、中、重度不典型增生，腺瘤、腺癌。表現(xiàn)出腸黏膜表面粗糙、皺褶變粗而不規(guī)則，可見(jiàn)單發(fā)或多發(fā)結(jié)節(jié)，有的帶蒂，直徑2~12mm不等。結(jié)節(jié)數(shù)目可多達(dá)20~30個(gè)，有的相互融合成巨塊，結(jié)節(jié)分布于直腸遠(yuǎn)端及近肛門(mén)處。
2.AOM法 ①連續(xù)4周腹腔注射氧化偶氮甲烷10mg/kg為最佳的給藥劑量，此最佳劑量與動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境無(wú)關(guān)，劑量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡率升高，劑量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致癌癥程度較輕，不同的致癌劑最佳劑量取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳背景和給藥方式。②每周腹腔注射氧化偶氮甲烷10mg/kg，連續(xù)4周，在第24周發(fā)生結(jié)腸癌的概率為100%。③不同遺傳背景小鼠對(duì)AOM的敏感程度不同，敏感性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋築ALB/C小鼠與ICR小鼠有相同的作用，對(duì)氧化偶氮甲烷最敏感，C57BL/6N小鼠其次。④AOM誘導(dǎo)小鼠大腸癌的發(fā)生是一個(gè)長(zhǎng)期的多階段的過(guò)程，與人類大腸癌發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞動(dòng)力學(xué)病理組織學(xué)和分子特征方面的變化特點(diǎn)非常相似。
3.AOM/DSS法 采用腹腔注射AOM(10mg/kg)和飼喂2%DSS飲水處理雄性ICR小鼠后，可觀察到炎癥導(dǎo)致腫瘤形成不同時(shí)期的病理學(xué)改變。第3周有2/5的小鼠出現(xiàn)結(jié)腸管狀腺瘤，第4周有2/5小鼠發(fā)生腺癌。此后，隨著時(shí)間推移，腫瘤發(fā)生率逐漸增加，第6周100％小鼠發(fā)生腺癌。所有時(shí)間點(diǎn)都可觀察到結(jié)腸不典型性增生。AOM/DSS模 型通過(guò)結(jié)腸黏膜的炎癥和不典型性增生使腸黏膜受損，促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生，伴有K-Ras和β-catenin基因突變、錯(cuò)配修復(fù)基因缺失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性改變。
【模型評(píng)估和應(yīng)用】：
1.CRC制備成功的概率主要取決于給藥的劑量、頻率、途徑、待續(xù)時(shí)間以及性別、周齡、遺傳背景等，同時(shí)腸道菌群、飲食、免疫狀態(tài)等可通過(guò)干擾致癌劑代謝來(lái)影響局部有效濃度。
2.DMH法和AOM法 致癌效果佳，器官選擇性好，腫瘤的發(fā)生部位、組織學(xué)類型以及腫瘤的發(fā)生過(guò)程均與人類直腸癌十分相似，可以較好地模擬人體直腸癌發(fā)生發(fā)展的實(shí)驗(yàn)研究，只是缺少人結(jié)直腸癌的前期腺瘤和后期易轉(zhuǎn)移的特征。模型制備方法簡(jiǎn)單，成模時(shí)間短，成瘤率高。
3.AOM/DSS模型 該模型是建立在炎癥基礎(chǔ)上重要的結(jié)腸癌模型之一，在致癌劑和致炎劑協(xié)同作用下模擬人類CRC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。利用該模型，結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的各種基因修飾，研究人員對(duì)炎癥相關(guān)性癌癥癌變機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究，尤其在分子機(jī)制、腫瘤微環(huán)境和藥物研究較多，目前應(yīng)用該模型涉及腫瘤干細(xì)胞的研究匱乏，有待科研工作者進(jìn)一步探索。由于AOM/DSS模型鮮見(jiàn)抑癌基因APC和p53突變，CRC發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移傾向低，而且患病后小鼠壽命縮短，故不適合用于腫瘤侵襲相關(guān)研究。
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