前言
經(jīng)典誘發(fā)性帕金森病動(dòng)物模型，多采用利血平、6-OHDA、MPTP誘導(dǎo)嚙齒類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物法。
部分造模方法
使用動(dòng)物：大鼠
【造模機(jī)制】：
1. 利血平是一種生物復(fù)合物，可以通過封閉囊內(nèi)不可逆的單胺的運(yùn)輸，消耗中樞和外周的單胺，導(dǎo)致肌肉僵硬，姿勢(shì)彎曲，運(yùn)動(dòng)減慢或無能，從而出現(xiàn)了與帕金森病相似的臨床癥狀。
2. 6-OHDA和DA的結(jié)構(gòu)相似。在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，6-OHDA被轉(zhuǎn)送至兒茶酚胺類神經(jīng)通路吸收系統(tǒng)，6-OHDA代謝導(dǎo)致眾多氧化應(yīng)激現(xiàn)象，由于自由基的形成最終使得DA神經(jīng)元抗過氧化系統(tǒng)破壞，隨著自由基對(duì)線粒體功能的損傷，其膜穩(wěn)定性和DNA完整性的破壞，最終致使細(xì)胞死亡。在注射6-OHDA的30分鐘內(nèi)即可觀察到6-OHDA對(duì)DA神經(jīng)元毒害作用，注射14~26天90％以上DA細(xì)胞丟失。將不同劑量的6-OHDA定位注射于大鼠的黑質(zhì)周圍和黑質(zhì)紋狀體通路上均能夠選擇性損毀黑質(zhì)內(nèi)DA神經(jīng)元，可模擬出自發(fā)性帕金森病的原始病理過程，最終產(chǎn)生類似自發(fā)性帕金森病。
3. 黑質(zhì)選擇性毒物MPTP，本身不具有神經(jīng)毒性，但可以穿越血－腦脊液屏障，并主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞和5-HT能神經(jīng)元內(nèi)的單胺氧化酶B作用后轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘缘?－甲基－4苯基吡啶離子(MPP+), 然后釋放到細(xì)胞外，MPP+不能穿越血－腦脊液屏障，而是經(jīng)由DA轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入DA能神經(jīng)末梢和胞體。MPP+對(duì)DA細(xì)胞的選擇性毒性源于它被選擇 性攝入神經(jīng)元，一旦進(jìn)入DA神經(jīng)元末梢，MPP+被逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至黑質(zhì)，從而通過干預(yù)線粒體，引起脂質(zhì)過氧化，使得膜結(jié)構(gòu)紊亂，影響細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致選擇性破壞黑質(zhì)DA能神經(jīng)元，導(dǎo)致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元大量死亡，紋狀體酪氨酸羥化酶陽(yáng)性纖維大量喪失，紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物3,4-二羥基苯乙酸、高香草酸水平均明顯降低，也有黑質(zhì)紋狀體小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞的增生和藍(lán)斑、下丘腦等區(qū)的損傷，與帕金森病患者的改變基本相同。
【造模方法】：
1. Wistar大鼠，體重200~220g,10周，腹腔內(nèi)注射一定劑量的利血平后可使其出現(xiàn)骨骼肌僵硬、震顫、身體屈曲、運(yùn)動(dòng)減少及其他的一些類似的帕金森病臨床主要運(yùn)動(dòng)癥狀。
2. 6-OHDA損傷大鼠帕金森病模型，6-OHDA定向性注射通常定位千中間前腦束，而不是黑質(zhì)致密區(qū)，因?yàn)榍罢甙怂袀鞒鲇诤谫|(zhì)致密層和前側(cè)蓋區(qū)的DA能神經(jīng)束。因此，與注射于黑質(zhì)致密區(qū)相比，當(dāng)6-OHDA注射在中間前腦束時(shí)，DA細(xì)胞丟失更多，而且6-OHDA在中間前腦束導(dǎo)致?lián)p傷的病理變化與觀察到的自發(fā)性帕金森病有極強(qiáng)的相關(guān)性。常用的6-OHDA損傷的大鼠帕金森病模型是6-OHDA單側(cè)損傷大鼠帕金森病模型。它是用6-OHDA單側(cè)注射大鼠中腦黑質(zhì)誘發(fā)的單側(cè)中腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元損毀模型。
立體定向毀損具體過程如下，將經(jīng)反復(fù)行為檢測(cè)確認(rèn)無旋轉(zhuǎn)行為的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用間隔注射兩點(diǎn)法制模：腹腔注射10％水合氯醛(40mg/kg) 將大鼠麻醉后，固定于Stoelting腦立體定向儀上（使雙側(cè)耳桿尖端插入外耳道，可聽到“咔嚓＂聲，并使頭部?jī)蓚?cè)保持在水平位置；門齒勾低于耳桿平面2.4mm，使前、后囟水平高度相差0.4mm以下）。常規(guī)消毒后，切開頭皮約1.0cm，剝離骨膜，確定右側(cè)黑質(zhì)致密部和中腦腹側(cè)被蓋坐標(biāo)，用針尖標(biāo)記。牙科鉆小心鉆透顱骨（注意勿損傷硬腦膜），按確定坐標(biāo)將微抵注射器連接于微最推進(jìn)器上，垂直入顱，緩慢進(jìn)針到預(yù)定深度，向黑質(zhì)致密區(qū)和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)各注射6-OHDA 8µg（溶于4µl含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％抗壞血酸的生理鹽水中），注射深度應(yīng)以針孔斜面中點(diǎn)為參照點(diǎn)，針尖向前，保證6-OHDA能準(zhǔn)確注入預(yù)定部位，注射速度為1μl/min，留針10分鐘，緩慢退針(1mm/min)。牙科膠覆蓋鉆孔，常規(guī)縫合傷口，連續(xù)腹腔注射青霉素5萬U一周以防止感染。
3. 大鼠對(duì)MPTP不敏感，不易誘發(fā)與帕金森病臨床相似的動(dòng)物模型，雖然小鼠相對(duì)敏感，但在30mg/(kg·d)劑量5~10天的作用下，黑質(zhì)A10區(qū)、藍(lán)斑、背核及下丘腦的神經(jīng)元仍不受任何影響。制作MPTP非人靈長(zhǎng)類帕金森病模型常采用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物全身靜脈、淺靜脈、頸總靜脈或腹腔注射MPTP方法進(jìn)行。選用成年非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，注射MPTP (0.2~0.5mg/kg)，每天1次，共15~18天，也有報(bào)道僅用4~6天（劑量大小不同、年齡選擇差異、注射部位和途徑不同造成的差別），所有動(dòng)物均能出現(xiàn)帕金森病樣癥狀，與人體產(chǎn)生的癥狀相似。
【模型特點(diǎn)】：
1. 運(yùn)用利血平誘發(fā)的大鼠帕金森病模型對(duì)快速評(píng)價(jià)治療帕金森病的藥物具有重要的價(jià)值。該模型迅速易得，但其癥狀會(huì)產(chǎn)生可逆性變化，該模型的缺點(diǎn)是不能深入復(fù)制自發(fā)性帕金森病的病理過程。因此，不能用于慢性DA消耗時(shí)產(chǎn)生的一些臨術(shù)變化的研究。該模型的另一缺陷在于，它與自發(fā)性帕金森病相比，當(dāng)5-HT、去甲腎上腺素降到一個(gè)很低的水平時(shí)，可能導(dǎo)致兩者產(chǎn)生不同的藥理學(xué)反應(yīng)。另外，通過注射酪氨酸類似物（1－甲基酪氨酸），可抑制DA和去甲腎上腺素的合成，對(duì)嚙齒類動(dòng)物具有與利血平誘導(dǎo)相似的功效，因此可選擇此方法復(fù)制帕金森病模型。
2. 由于同側(cè)紋狀體DA功能的喪失，動(dòng)物表現(xiàn)出向與6-OHDA引起的損傷部位相反側(cè)自發(fā)旋轉(zhuǎn)，暗示神經(jīng)節(jié)向丘腦和中腦運(yùn)動(dòng)區(qū)發(fā)出的沖動(dòng)減少，該模型對(duì)于了解黑質(zhì)紋狀體通路降解時(shí)病理、電生理和藥理學(xué)變化非常有用，有利于我們對(duì)帕金森病癥狀產(chǎn)生機(jī)制的理解。假設(shè)在帕金森病中這種沖動(dòng)屬于過量運(yùn)動(dòng)，那么這種行為所代表著的就是抗帕金森病的作用。盡管6-OHDA單側(cè)損傷復(fù)制的大鼠帕金森病模型與帕金森病患者在病理學(xué)、藥理學(xué)的變化相似，但是這種動(dòng)物模型仍存在一些缺點(diǎn)。由于在這個(gè)模型中6-OHDA的損傷屬單側(cè)，通過大腦非損傷側(cè)補(bǔ)償介導(dǎo)的通路，可以影響大腦的單側(cè)作用DA消耗的改變。6-OHDA制備的大鼠模型需要立體定向儀等特殊設(shè)備，制作技術(shù)要求高，但大鼠易控制，來源廣，價(jià)格低，行為持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)且觀察方便，因而是常用的模型之一。
3. MPTP誘導(dǎo)的嚙齒類動(dòng)物模型所表現(xiàn)的癥狀和病理變化與人帕金森病臨床主要體征相去甚遠(yuǎn)。目前看來沒有太大的推廣價(jià)值。MPTP制備的非人靈長(zhǎng)類帕金森病模型方法簡(jiǎn)單，行為體征、病理特征與人類更相似，加之非人靈長(zhǎng)類進(jìn)化上的類人性、觀察和取材的易操作性，而廣泛受到人們的歡迎。此模型明顯優(yōu)于6-OHDA模型，是目前應(yīng)用最廣泛的模型。
【模型的評(píng)估和應(yīng)用】：
1. 應(yīng)用利血平模型迅速發(fā)現(xiàn)了L-DOPA可作為治療帕金森病的潛在藥物。到目前為止，這種藥物依然是臨床治療帕金森病的首選藥物和主要藥物。
2. 6-OHDA單側(cè)損傷復(fù)制的大鼠帕金森病模型，可從模型動(dòng)物旋轉(zhuǎn)數(shù)量和方向上加以評(píng)估。由于動(dòng)物行為特異性差異，判斷大鼠帕金森病模型是否成功，通常以動(dòng)物出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為的次數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，一般超過7轉(zhuǎn)／min即為成功的帕金森病模型，否則為不成功模型。6-OHDA損傷動(dòng)物引起的旋轉(zhuǎn)被認(rèn)為是抗帕金森病的行為，但諸如震顫、強(qiáng)直和運(yùn)動(dòng)減慢等帕金森病的主要臨床癥狀卻沒在這些動(dòng)物中出現(xiàn)。通過雙側(cè)注射6-OHDA在嚙齒類動(dòng)物中間前腦束引起損傷的辦法也可誘導(dǎo)出帕金森 病癥狀，但是一些不利的癥狀包括吞咽困難、高致死率等使得這些帕金森病模型無法廣泛應(yīng)用，因而不常用。當(dāng)直接向紋狀體注射6-OHDA時(shí)，一些動(dòng)物紋狀體DA中樞端通路發(fā)生部分耗竭，在這種帕金森病模型中，紋狀體神經(jīng)元退化速率非常緩慢。與中間前腦束注射6-OHDA相比，向紋狀體注射6-OHDA時(shí)，黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元退化的速度與自發(fā)性帕金森病極其相似。但是，經(jīng)紋狀體注射6-OHDA引起部分損傷，紋狀體中DA耗竭不足可以引起異常運(yùn)動(dòng)。因此，當(dāng)評(píng)估治療帕金森病能力時(shí)，不能使用向紋狀體注射6-OHDA復(fù)制的帕金森病動(dòng)物模型。
3. 非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物是人類進(jìn)化過程的近親，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育學(xué)上表現(xiàn)出與人類密切的相關(guān)和相似性，且其行為與人類行為的可比性，都提示著研究者對(duì)它們的關(guān)注。MPTP意外發(fā)現(xiàn)和在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體的使用，使帕金森病動(dòng)物模型的各方面研究有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。MPTP損傷后，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物會(huì)顯示姿勢(shì)異常、運(yùn)動(dòng)減少、四肢緊張彎曲、肢體強(qiáng)直伴有震顫、吞咽困難、不能進(jìn)食、發(fā)音減弱、定向反應(yīng)性減弱等體征。動(dòng)物反應(yīng)的程度與MPTP劑量及動(dòng)物年齡有關(guān)，給予L-DOPA后所有癥狀減輕。
前面提及的對(duì)放線菌素等一類細(xì)菌、真菌和植物可合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)酵解抑制劑在大鼠的研究結(jié)果，同樣在非人靈長(zhǎng)類帕金森病模型的研制中引起關(guān)注。美國(guó)Machel Jackson Foundation、英國(guó)Motac Neuroscience、法國(guó)Basal Gang等跨國(guó)研究機(jī)構(gòu)和組織均已在這方面的研究中有所投入。使PSI導(dǎo)致非人靈長(zhǎng)類帕金森病的研究成為該病非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型制作的新熱點(diǎn)話題。李秦等和Motac Neuroscience開展合作研究，已經(jīng)開始并且階段性地完成了部分研究工作，研究發(fā)現(xiàn)該方法制造的非人靈長(zhǎng)類帕金森病模型具有較高優(yōu)越性：①造模制劑毒性溫和，沒有廣泛的急性毒副作用，不會(huì)引起動(dòng)物癱瘓和死亡，大大降低造模風(fēng)險(xiǎn)；②造模過程相對(duì)緩和，在動(dòng)物機(jī)體不出現(xiàn)劇烈體征波動(dòng)的情況下，即可完成模型的制作，更加近似于人類原發(fā)性帕金森病的病理過程；③在腦內(nèi)形成的病變更類似于人類，尤其是黑質(zhì)中DA神經(jīng)元的缺失的PET檢驗(yàn)更加能夠表明其模型相似性；④動(dòng)物模型的行為表現(xiàn)與MPTP損傷穩(wěn)定后的模型無明顯差異。對(duì)于在黑質(zhì)DA神經(jīng)元中是否可見Lewy樣包涵體，還要進(jìn)一步觀察。
綜上所述，由于帕金森病發(fā)病機(jī)制并不是很明確，現(xiàn)有模型和自發(fā)帕金森病不具有完全相同病因?qū)W，但一定有相似性。已有的幾種非人靈長(zhǎng)類和嚙齒類動(dòng)物模型都是通過對(duì)腦部施加實(shí)驗(yàn)因素完成的，這些模型都不會(huì)出現(xiàn)與原發(fā)性帕金森病完全相同的病理生理改變和神經(jīng)分化模式，特別是在疾病進(jìn)行性變化方面更不能很好體現(xiàn)。在目前還沒有更好的造模方法的情況下，可以說，MPTP誘導(dǎo)的非人靈長(zhǎng)類帕金森病模型是目前較為成熟、有價(jià)值的帕金森病研究載體，MPTP制備的非人靈長(zhǎng)類帕金森病模型，方法簡(jiǎn)便，行為和病理方面的變化與人相近。PSI誘導(dǎo)的非人靈長(zhǎng)類怕金森病模型不但涵蓋了MPTP制備的非人靈長(zhǎng)類帕金森病模型的所有優(yōu)點(diǎn)，而且在疾病發(fā)生上更加與人類原發(fā)性帕金森病相似，是環(huán)境毒素致病學(xué)說的有力佐證，有廣闊開發(fā)和應(yīng)用前景。
類似于人的帕金森病臨床繼發(fā)癥，利用MPTP誘導(dǎo)獼猴出現(xiàn)帕金森病主要體征之后，機(jī)體也會(huì)出現(xiàn)很多病理、生理、代謝功能上的變化，這些綜合因素共同作用的結(jié)果就會(huì)使動(dòng)物出現(xiàn)各種各樣的臨床癥狀。隨著帕金森病三大主要體征：運(yùn)動(dòng)減慢、震顫和強(qiáng)直的出現(xiàn)和加劇，動(dòng)物的食欲和采食能力也不斷下降，若不及時(shí)采取相應(yīng)的對(duì)策和有效的處理方法，動(dòng)物的體質(zhì)將迅速降低，出現(xiàn)消化不良、便秘、消瘦、肌肉萎縮等與營(yíng)養(yǎng)有關(guān)的其他體征，進(jìn)一步發(fā)展，動(dòng)物的免疫功能也逐漸低下，條件致病病原體感染隨之出現(xiàn)。這在已處于帕金森病主要體征狀態(tài)下的動(dòng)物就很有可能無法承受，致動(dòng)物救治無效于成模中途死亡，實(shí)驗(yàn)失敗。因此，一套有效的繼發(fā)癥防治方案和一個(gè)良好的、全價(jià)的、易于帕金森病態(tài)下動(dòng)物消化吸收的營(yíng)養(yǎng)食物配方對(duì)保障大批量造模工作的順利進(jìn)行是非常重要的。很多研究人員在造模過程中會(huì)遇到此類問題，需要結(jié)合其具體情況對(duì)帕金森病模型動(dòng)物可能出現(xiàn)的各種并發(fā)癥有針對(duì)性進(jìn)行預(yù)防和處置，以保證模型動(dòng)物的長(zhǎng)期維持。
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